肺炎支原體耐藥A2063G怎么辦-耐藥支原體肺炎 治療方案

病原學檢測技術在兒童呼吸系統感染性疾病中的合理應用

呼吸系統感染性疾病是兒童最常見的感染性疾病，肺炎是5歲以下兒童病死的首位原因，嚴重威脅兒童生命健康。

呼吸系統感染的病原種類繁多，且不同病原感染臨床表現有相似之處，給臨床診療帶來了極大挑戰。

對嚴重的下呼吸道感染患者，臨床醫生早期通常會在病原未明的情況下經驗性使用廣譜抗菌藥物治療。

廣泛的經驗性使用抗生素不僅增加了相關不良作用和醫療費用，更會增加細菌耐藥風險。

病原體的快速鑒定是兒童呼吸系統感染性疾病早期診斷和合理用藥的基礎，對指導臨床診療十分重要。

為規范兒童呼吸系統感染病原體檢測技術的臨床應用，提升病原體的診斷水平，本文對病原體檢測常用檢測技術在呼吸系統感染性疾病中的應用進行論述，以指導兒童呼吸系統感染病原體檢測技術的合理應用，提升兒童呼吸系統感染的病原診斷能力。

病毒抗原檢測適于早期篩查，多重聚合酶鏈式反應檢測助力呼吸道病毒的快速和精準診斷

口咽拭子和鼻咽拭子的膠體金法病毒抗原檢測是病毒檢測較為常用的手段，方法簡便，無檢測環境和人員的要求，約30min即可出結果，且檢測成本較低，特異度較高，推薦應用于門急診呼吸道病毒感染的早期篩查，對臨床決策指導合理用藥意義較大。

但由于取材來源和樣本病毒量不穩定及檢測技術本身的問題，敏感性低。

病毒核酸檢測可在較短時間內獲得檢測結果，敏感度和特異度較高，并可鑒定病毒亞型及檢測病毒相對載量。

病毒核酸檢測可用于不同呼吸道樣本，包括鼻咽、口咽分泌物、痰液、支氣管肺泡灌洗液、胸腔積液和活檢肺組織等。

實時熒光定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）是最常用的方法。

多重PCR是在普通PCR技術上發展起來的，可同時檢測多種病原體，對樣本量的要求較低，檢測時間短，可實現高通量、高靈敏度、高特異性檢測，臨床應用價值較高。

一項涉及5510個樣本的薈萃分析顯示多重PCR檢測病毒靈敏度和特異性分別為94.0%和98.7%，與傳統檢測（例如快速抗原檢測和病毒培養）相比，多重分子檢測的準確性更高。

然而，它的多引物設計會導致假陽性率增加，其對殘留污染檢出率較高也對實驗室封閉反應系統提出了更高的要求，尚不適用于實驗室條件相對不足的基層醫院。

多重PCR檢測技術是目前臨床最常用的可靠方法，可用于門急診和住院患兒的早期快速病毒診斷，在高度懷疑病毒感染、病毒抗原快速檢測陰性時也有重要作用。

機體感染病毒后首先出現特異性免疫球蛋白M(immunoglobulin M，IgM）升高，特異性IgM抗體檢測可用于門診、急診或基層醫院的病原體篩查。

但機體產生IgM在感染后1周左右，早期陽性率低。

另外，感染后IgM可持續3～6個月甚至更久，檢測陽性需結合臨床做出判斷[7]。

血清IgG抗體檢測需采集急性期及恢復期雙份血清進行比較，且體液免疫缺陷的患者可呈假陰性，因此早期診斷價值有限。

病毒分離培養是診斷的金標準，特異度高，可進行病毒鑒定分型，但其實驗要求高，操作復雜，檢測時間較長，且敏感度差，不適合臨床常規開展。

病原培養是協助臨床診斷細菌感染最常用、最可靠的手段

呼吸道標本培養協助診斷細菌感染仍是臨床應用的主流方法，可取下呼吸道分泌物、胸腔穿刺液、肺活檢組織等標本進行病原培養和分離，并對培養的細菌進一步進行藥敏試驗，從而指導臨床治療。

對于社區獲得性肺炎，早期痰液培養是目前臨床最常用的方法。

肺泡灌洗液培養是明確細菌性肺炎的重要依據，因有創性檢查，推薦用于經驗抗生素治療無效的肺炎、重癥肺炎、免疫功能低下等患兒。

但細菌培養周期較長，且抗生素應用會使培養的敏感性降低，常需聯合其他檢測方法來明確診斷。

涂片染色鏡檢亦是發現細菌感染的重要方法，它的優點是快速、直觀、成本低，臨床易于開展，推薦呼吸道標本培養前常規進行涂片染色鏡檢，對于早期發現感染病原菌有一定的指導意義。

某些細菌感染還可進行快速抗原檢測。

如尿肺炎鏈球菌抗原在發病1d內即可被檢測到，且兒童尿標本簡單易獲取，對于呼吸道感染的兒童可通過測定尿抗原來實現肺炎鏈球菌的快速、早期診斷。

銅綠假單胞菌是下呼吸道感染常見致病菌，特別是醫院獲得性肺炎、呼吸機相關性肺炎以及支氣管擴張、肺囊性纖維化等患者，多重耐藥銅綠假單胞菌導致的下呼吸道感染與更高的病死率有關。

以實時熒光定量PCR為基礎的檢測方法可直接檢測耐藥基因，也可通過檢測不同藥物濃度下目的基因擴增推斷該抗菌藥物濃度是否有效，還可通過逆轉錄PCR檢測不同藥物濃度下目的基因轉錄水平評估細菌的耐藥性。

qPCR檢測速度快，但耐藥表型可能涉及多種基因突變及表達，僅檢測單一耐藥基因可能無法準確預測耐藥表型。

上呼吸道樣本的PCR檢測對百日咳感染的診斷有重要意義，具有快速、準確、敏感度高（>90%）、特異性強（>95%）等特點，特別適合嬰幼兒及未接受免疫接種的兒童及咳嗽<2周的患者。

咽拭子細菌培養是百日咳的標準檢查方法，特異度100%，但培養周期長且敏感性低，特別是對經過抗生素治療或標本采集時間過晚的患兒，可作為分子檢測方法的補充，可用于分子檢測陽性及沒有條件開展分子檢測的實驗室。

實時聚合酶鏈式反應是目前診斷肺炎支原體感染的首選方法

肺炎支原體（mycoplasma pneumoniae，MP）培養是診斷MP感染的金標準，特異度高，且可通過體外藥敏試驗判斷是否為耐藥菌，但需特定培養基，且程序復雜、耗時長，靈敏度較低，不能滿足臨床快速診斷的需求。

MP血清學酶聯免疫吸附試驗是應用較廣泛的檢測肺炎支原體感染的方法，但MP-IgM在感染后約1周檢測到，無法早期診斷，在一定程度上會影響重癥和/或難治性病例的早期干預。

膠體金免疫層析試紙條檢測法可定性檢測MP-Ig M，試驗結果可在5～10min內通過肉眼進行觀察，該檢測方法無需任何儀器設備，具有方便、快速、廉價等優點，但報告結果只顯示陰性或陽性，不能報告滴度，適宜在一般基層醫院和門急診快速篩查開展應用。

顆粒凝集法通過檢測恢復期和急性期MP抗體滴度呈4倍及以上增高或減低時可以確診肺炎支原體感染，難以用于急性感染的早期診斷。

MP抗原檢測特異度和靈敏度均較高，且無需專業儀器設備，操作簡單快速，在早期和快速檢測中具有潛在臨床價值，但其具有高特異度和高假陰性的特點，更適用肺炎支原體感染的初篩。

MP分子檢測技術主要為核酸擴增技術，包括DNA擴增和RNA擴增，具有周轉時間快、污染可能性低、靈敏度高、特異度高、不受時間和免疫功能限制等優點，已被認為是診斷MP感染的金標準。

通過PCR法還可直接檢測呼吸道標本耐藥基因突變，獲得結果快，在臨床得到廣泛應用。

基因點突變導致的靶點改變是MP對大環內酯類耐藥的最重要原因，23S rRNA對結構域Ⅱ區和V區與抗生素直接結合的堿基點突變可導致抗生素與核糖體親和力下降而引起耐藥，可通過測定23S rRNA的2063、2064等位點突變判斷耐藥與否。

但所檢測的耐藥狀況與臨床療效并不完全一致，臨床結局可能還與大環內酯類藥物的免疫調節作用以及病程自限等因素有關。

檢驗新技術助力結核病的快速診斷

結核分枝桿菌最常用的檢測方法是涂片法，痰涂片是一種快速低廉、操作簡便、被臨床廣泛應用的方法，但該方法無法區分死菌和活菌，尤其是無法區分結核分枝桿菌和非結核分枝桿菌，且受制于痰液中分枝桿菌數量，敏感性較低。

結核菌培養陽性是診斷結核診斷的金標準，與痰涂片相比，培養法雖然靈敏度增加不少，但檢測周期太長，不但貽誤治療，也增加了傳播時間。

結核分枝桿菌抗原陽性可作為結核感染的直接證據，且不受結核病患者免疫狀態的影響。

由于單克隆抗體制備技術的發展，目前已可制備高效價的特異性抗體，使檢測血清中的結核桿菌抗原成為結核診斷的新方法。

結核菌素試驗是檢測機體對結核桿菌免疫反應的經典方法，具有操作簡便、價格便宜的優點，但試驗結果受卡介苗接種及人體免疫狀態的影響，在嚴重播散性結核病和免疫抑制兒童患兒中常出現假陰性。

γ-干擾素釋放試驗是通過檢測結核分枝桿菌特異性抗原刺激T細胞產生的γ-干擾素來判斷是否存在結核分枝桿菌感染；特異度高，不受卡介苗接種及大多數非結核分枝桿菌的干擾，且使用外周血標本進行檢測不接觸活菌，減少了人員感染的風險。

但γ-干擾素釋放試驗不能很好區分是活動性結核與陳舊性結核。

實時熒光PCR法檢測結核桿菌核酸，可提升結核桿菌的檢出率，準確率和敏感度均較高，結果與分離培養法檢測結果有較高的一致性。

以RNA為檢測靶標的檢測技術方法使用16S rRNA為靶標，其靈敏度和特異度很高，是目前市場上唯一可以區分結核分枝桿菌和非結核分枝桿菌的分子生物學檢測方法。

GeneXpert是一種全自動化分子診斷系統，是以結核分枝桿菌的RNA聚合酶活性位點編碼區為靶標，采用半巢式實時半定量PCR進行病原體檢測的方法。

對于臨床疑似肺結核患兒、耐多藥肺結核患兒，GeneXpert可先于抗酸染色或細菌培養作為初篩方法。

目前，GeneXpert技術用于檢測結核分枝桿菌主要為結核分枝桿菌復合群快速分子鑒定及利福平耐藥性檢測（GeneXpert MTB/RIF)，GeneXpert MTB/RIF是通過檢測結核分枝桿菌基因組中的rpoB基因及其突變情況，實現結核分枝桿菌核酸和利福平耐藥檢測的全自動實時熒光定量核酸擴增技術。

它具有以下優勢：特異性好，能準確區分結核分枝桿菌和非結核分枝桿菌；靈敏度高，檢測快速，僅需要2h就完成檢查了，適用于各種標本，如痰液、肺泡灌洗液、肺組織、腦脊液、淋巴結、關節液以及尿液等均可用于檢測；同時可以檢測利福平耐藥，檢測對一線抗結核藥物利福平的耐藥情況，敏感性特異性極高。

GeneXpert MTB/RIF還可以應用于肺外結核及兒童結核的診斷，但不足的是該系統的設備和試劑盒成本均較高，故短期內是無法實現其在基層結核病實驗室及醫療機構進行普及使用。

多種檢測技術聯合應用協助真菌的診斷

可引起肺部真菌感染的病原體種類較多，比較常見的包括隱球菌屬、曲霉屬、毛霉屬、肺孢子菌屬等。

顯微鏡檢法檢測真菌操作簡便、快速，不需要特殊儀器設備，適合在各級實驗室開展，但靈敏度相對較低，病原菌數量少時難以發現，且需要臨床人員有一定的臨床檢驗工作經驗。

分離培養是診斷真菌感染的金標準，但部分真菌培養困難，如毛霉目，有時顯微鏡檢可見大量菌絲，但培養陽性率不高，特別是呼吸道標本處理不當常導致毛霉目真菌菌體被損壞，生長困難。

另外，曲霉屬與毛霉目真菌在周圍環境中可見，也可以孢子形式被吸入呼吸道而定植。

因此，對培養陽性者應結合臨床以區分真菌感染、環境污染及呼吸道定植。

肺部真菌感染常用的免疫學診斷試驗包括1，3-β-D葡聚糖試驗（G試驗）、半乳甘露聚糖抗原試驗、曲霉免疫球蛋白G抗體試驗、隱球菌莢膜多糖抗原試驗等。

G試驗可檢測隱球菌和接合菌以外的真菌，陰性結果意義較大，可排除判斷未發生隱球菌和接合菌以外的真菌感染；但受飲食、藥物如白蛋白、抗菌藥物等影響較大，易出現假陽性，需根據臨床情況進行判定。

半乳甘露聚糖抗原試驗主要用于輔助診斷侵襲性肺曲霉病，在中性粒細胞缺乏患者中易出現假陰性。

隱球菌莢膜多糖抗原試驗在診斷隱球菌感染中具有極重要的價值，對于肺隱球菌病，支氣管肺泡灌洗液的隱球菌抗原檢測有高度的特異度和敏感度。

曲霉免疫球蛋白G抗體試驗在超敏反應性支氣管肺曲霉病與慢性肺曲霉病診斷中有較好的應用價值。

目前最常見的檢測真菌感染的分子生物學方法是PCR，但其在真菌檢測中的應用相對較少，主要原因在于真菌的細胞壁較厚，常規方法下核酸提取困難。

近年來，宏基因組二代測序的出現及臨床應用為肺部真菌感染的診斷提供了非常重要的手段，使臨床診斷下呼吸道真菌感染的方法更加豐富，具有重要的臨床價值。

宏基因組二代測序是兒童疑難、重癥呼吸系統感染性疾病病原診斷的重要補充

宏基因組二代測序（metagenomic next generation sequencing，m NGS）技術是近年來興起的非序列依賴的新型核酸檢測方法，由于其非預設性、高通量等優點而得到廣泛應用。

m NGS無需事先對樣本進行特異性擴增，且能夠無偏倚地在同一樣本中同時檢測已知或者未知的細菌、真菌、寄生蟲和病毒，還能明確微生物的抗生素耐藥情況。

在未知病原菌的感染性疾病暴發調查、傳統檢測結果陰性的感染患者、免疫缺陷患者及危重癥感染患者的應用中均已證明了mNGS的獨特優勢。

可檢測的標本包括血液、痰液、肺泡灌洗液、胸腔積液等。

與傳統檢測技術比較，mNGS對標本選擇不具有偏向性，且靈敏度特異度高、通量高，可有效發現新發病原，實現精準診斷。

對于兒童呼吸道感染，在病因不明且病情危重需要盡快明確病原體、疑似新發或特殊病原體感染、傳統微生物檢測技術多次陰性且治療效果不佳等情況下，可以在常規病原檢測的同時或在其基礎上對樣本進行mNGS分析，以高效獲取感染病原體的信息。

在檢出細菌及真菌方面，肺泡灌洗液標本具有更高的敏感性，而在檢測病毒方面，外周血標本檢出率更高，腺病毒肺泡灌洗液和血mNGS同時可以檢出。

但由于mNGS操作程序復雜，對環境和人員要求較高，難以在基層實驗室開展，且檢測成本高，不推薦作為常規檢測項目，主要用于重癥感染、難以治愈的慢性感染、復雜/混合感染和免疫缺陷患兒感染的診斷[30]。

另外，m NGS檢測過程混雜因素較多，不同的方法、平臺、質控都可能影響結果，標準流程有待統一。

綜上所述，傳統呼吸道病原體檢測手段如培養、涂片因敏感性和時效性差，不利于呼吸系統感染性疾病早期臨床診斷和治療。

呼吸道感染病原體抗原或抗體檢測的多聯檢測時效性高，可用于早識別感染，并指導抗感染藥物的合理使用。

快速分子檢測的發展在很大程度上有助于加快呼吸系統感染性疾病的診斷，是對傳統培養方法的有效補充，但不能完全替代傳統培養方法。

mNGS檢測對呼吸道病原體的早期發現，特別是疑難、急危重癥及混合感染診斷等方面具有明顯的優勢。

在臨床應用上，可以將傳統的涂片、培養、抗原、抗體等檢測方法與分子檢測方法相結合，發揮優勢互補，從而快速、準確識別呼吸道病原體、指導臨床治療。